百晓生 | LncRNA相关研究这么多,这些策略你知道吗?

更新日期:2019-03-13
解螺旋

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对于乳腺癌来说,MALAT1到底是抑制了转移还是促进了转移呢?

今天就以发表在Nature Genetics这篇“Long noncoding RNA MALAT1 suppresses breast cancer metastasis”文章为切入点,说的是lncRNA MALAT1抑制乳腺癌的转移,问题是大部分文章是说MALAT1促进乳腺癌等肿瘤的转移。

到底哪里出问题了呢? 之所以会出现促进转移的表型,是因为MALAT1这个基因的位置位于临近基因(NEAT1,FRMD8)的转录调控区,当我们通过基因敲除的方法把这段MALAT1基因的序列敲掉后,不仅会敲除 MALAT1基因,其临近基因的表达也会受到影响。

目前大多数的功能性研究都集中在使用siRNAs、shRNAs或者ASOs,这些RNAs只能干扰已经生成的RNA转录本,不能有效的消耗lncRNA的靶标,并且可能产生一些意想不到的后果。siRNAs/shRNAs主要在细胞质中活化来介导RNAi,而lncRNA的靶标通常在核里。

此外,越来越多的证据表明siRNAs/shRNAs可通过转录基因沉默改变细胞核中的转录。因此,使用siRNAs/shRNAs产生的功能性结果可以通过染色质的表观遗传沉默和/或RNA聚合酶II活性的降低来间接介导,这种作用效果的不确定性增加了研究者对ASO介导方法的偏好。

现有研究表明,ASO是通过RNaseH依赖性机制引发细胞核中RNA的降解(如下图所示),并且尚未有报道指出这种机制可以改变染色质的结构。因此,当前实验方法的局限性阻碍了lncRNA转录过程中的作用与lncRNA本身分子作用的全面分离。

为了阻断转录,许多研究采用了RNA聚合酶II起始或延伸的抑制剂,但这些抑制剂往往也会抑制靶基因的转录,因此它们在功能研究中的用途就受到了限制。

目前,基于启动子缺失和插入转录终止位点的基因编辑技术,使用序列特异性核酸酶,如锌指酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALENs)或CRISPR/Cas9是非常有前景的研究lncRNA功能的方法。

前面提到的“Long noncoding RNA MALAT1 suppresses breast cancer metastasis”中作者采用CRISPR方法在基因组上引入终止子(如下图所示),从而可以更真实的反应MALAT1本身的生物学功能。

而调节位点的deletion是不能够区分是DNA序列的作用还是由该区域产生的lncRNA的作用。因此,在基因组上引入终止位点可能是研究lncRNA比较有前景的方法,而对于eRNA (Enhancer RNA),其合成往往是在转录起始位点的下游终止,所以这种方法也不会改变大多数eRNA的产生。

近年来,CRISPR interference (CRISPRi) 和CRISPR activation (CRISPRa)基于核酸酶活性失活的Cas9 (dCas9)与效应结构域 (干扰或激活)融合,这项技术将为研究ncRNA提供更好的手段。此外,通过对RNA聚合酶II形成空间位阻,单独使用dCas9而不与效应结构域融合来实现的CRISPRi可以在不改变局部染色质结构的基础上来研究ncRNA转录的作用。

然而,尽管有很多工具可用,但是迄今为止尚未开发出用于阻止特定位点的转录而不影响该区域的其他特征的好方法。总之,为了得到可靠的实验结果,我们应该使用多种不同的方法来进行功能缺失实验,做下游靶基因或者临近基因的改变的话,需要通过Rescue实验进一步验证,以确保得到科学的结论。

下图是对研究lncRNA所使用的策略总结,还有每种策略的局限性:

技术推动科学的发展,在科学研究的道路上还需要我们不断创新开发更好的工具来探索生命科学的奥秘,大家努力加油吧!


附:关于lncRNA敲减策略选择

关于lncRNA干扰策略问题,虽然siRNAs/shRNAs/ASO已经成功地用于干扰特定的lncRNA,但每种方法对于不同的lncRNA起到的干扰效果可能会有所不同。首先要考虑的就是lncRNA的亚细胞定位。


如下Fig.1所示,针对于细胞核定位的两种lncRNA (MALAT1和NEAT1),使用ASO明显比siRNA起到更好的抑制效果;针对于细胞质定位的lncRNA (DANCR和OIP5-AS1),如Fig.2所示,siRNA发挥出了明显的优势;而对于细胞核和细胞质都有定位的lncRNA (YUG1、CasC7、HOTAIR),单独使用siRNA或ASO都没有前面两种效果好(Fig.3)。


 

Fig.1

Fig.2

Fig.3


但是,联合使用siRNA和ASO却能达到很好的敲低效果,并且针对于单纯细胞核定位或是细胞质定位的lncRNA而言,ASO和siRNA一起使用都比单独使用有更好的干扰效果(图4)。有趣的是,对细胞质定位的lncRNA采用ASO敲低可能比siRNA作用于细胞核定位的lncRNA更为有效(如图5)提示我们细胞质中RNaseH1的活性水平可能高于我们先前了解的水平。最近研究表明转染ASO后,mRNA降解的限速步骤与RNaseH1的数量有关,进一步表明了在细胞核和细胞质中都有RNaseH1活性。


 

Fig.4

Fig.5


总之,当我们要干扰lncRNA时,首先考虑其定位,反义寡核苷酸ASO用于细胞核定位lncRNA,RNAi用于细胞质定位lncRNA,当lncRNA定位未知时,如果只用一种方法的话,优先选用ASO敲低可能会更好,联合使用ASO和RNAi往往会达到比单一方法更有效的敲低效果,这种联合方法又特别适用用核质双定位的lncRNA。

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